罗非鱼无乳链球菌的DIG-cfb原位杂交检测方法的建立

• 作者: 刘志刚 卢迈新 可小丽 方伟 曹建萌 曾祖聪 袁伟
• 来源期刊: 中国农学通报
• 学科: 农学
• 关键词: 无乳链球菌 cfb基因 PCR 地高辛标记探针 原位杂交
• 年，卷（期）: 2015,（35）
• 所属期刊栏目: 水产·渔业
• 页码范围: 66-72
• 分类号: S854.4+4
• 语种: 中文

摘要

为建立一种批量检测罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的快速敏感的原位杂交方法,本研究依据罗非鱼无乳链球菌cfb基因序列,选取其132-599 bp之间的序列为靶序列,采用PCR法制备了特异性地高辛标记的DNA探针DIG-cfb(Digoxigenin-labelled cfb probe,430bp),同时对所制备的探针进行了测序鉴定及特异性和敏感性检测.结果表明,探针测序序列与实际GenBank序列相符,所制备的DIG-cfb探针与无乳链球菌基因组杂交呈阳性,与患病罗非鱼的其他细菌病原(嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、类志贺邻单胞菌以及海豚链球菌)基因组,以及与无乳链球菌亲缘关系较近的链球菌其他种(牛源链球菌、变异链球菌),斑点反应则均为阴性,dNTP对照组也为阴性,表明该方法特异性强;该方法可实现对批量样品的快速检测,具有较高的灵敏度,可检测无乳链球菌基因组的下限为1.5 ng/μLDNA.对采集于广东、海南及广西等不同地点的无乳链球菌样品,均可获得较明显的斑点反应圈,对患链球菌病的罗非鱼肝、脑组织基因组也可特异的检测出无乳链球菌.表明本研究建立的DIG-cfb原位杂交法对无乳链球菌基因组的检测具有快速、特异、敏感等特点,适合罗非鱼无乳链球菌的批量检测.