大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

• 作者: 俞建雄 葛坚 袁静
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 干细胞 培养 神经母细胞特异性转移因子 重组腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 病毒滴度 视神经再生 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2015,（41）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 干细胞基础实验
• 页码范围: 6699-6705
• 页数: 7页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6205字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.025

摘要

背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法：用 XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体， PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染 HEK293细胞进行包装、扩增，采用 PCR 法对重组腺病毒进行鉴定， TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含 ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	葛坚	中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室	105	969	16.0	25.0
2	袁静	武汉大学人民医院眼科中心	37	228	8.0	14.0
3	俞建雄	武汉大学人民医院普外科	5	16	2.0	4.0