6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

• 作者: 何雷 余祖华 张春杰 李银聚 杨丹芳 梅京京 程相朝 金修哲 韩海锋
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 中药成分 猪传染性胃肠炎病毒 抗病毒作用 咖啡酸
• 年，卷（期）: 2016,（11）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 2234-2244
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.019

摘要

[目的]为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据.[方法]利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞(ST)的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID50,用细胞维持液配成1 00·TCID50病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6种中药成分与病毒作用后,测定TGEV的病毒滴度并进行比较分析、RT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用.[结果]连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、1 00、200μmol·L-1;抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为:160、100、20、62.5、2 5、100 μmo 1·L-1.根据Karber法计算出初始TGEV的TCID50为10-6.25/0.1 mL;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5 μmol·L-1时与100·TCID50病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID50为10-3.75/0.1 mL,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10-6.45/0.1 mL差异极显著(P＜ 0.01);通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4％,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著.其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为:10-4.15、10-5.55、10-5.55、105.65、10-5.75/0.1 mL,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著,抑制率大多在50％以下.另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用.RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显著;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚.[结论]6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著,有望被开发成抗病毒药物.