突变型人源乙酰胆碱神经受体α7的构建表达纯化

• 作者: 张斯维 王旻 程浩
• 来源期刊: 药物生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 神经型乙酰胆碱受体 BacMam哺乳动物细胞表达 亲和纯化 电子显微镜
• 年，卷（期）: 2016,（2）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 95-98
• 页数: 4页
• 分类号: Q786
• 语种: 中文

摘要

为增强神经型乙酰胆碱受体(nAChR)蛋白的稳定性和表达量,以满足晶体学研究的要求.根据同源蛋白的氨基酸序列比对结果,设计了胞内5个切除位点,设计合适的引物,利用分子克隆的方法扩增出相应的改造后cDNA序列并构建到BacMam表达载体,最后利用BacMam杆状病毒表达系统构建表达突变型重组杆状病毒,并转染到HEK293F哺乳动物细胞中,诱导表达重组蛋白.采用免疫印迹法小规模表达检测后,选取合适突变型进行表达,并利用MBP亲和层析和分子排阻法进行两步纯化后,通过电子显微镜负染技术检测纯化后的蛋白质量.结果显示,成功克隆并表达了乙酰胆碱神经受体α7的5种不同的胞内区域突变型,且蛋白表达量与野生型相比均有所提高,其中P5突变型表达量最高.经表达纯化后,能够获得毫克级别的乙酰胆碱受体蛋白,并且电子显微镜观察的结果表明蛋白呈现出相对稳定的五聚体形貌,大小尺寸与理论相符.