花生iso-ARah3基因克隆及多克隆抗体制备

• 作者: 姜焕焕 潘丽娟 王冕 王通 祁佩时 迟晓元 郝翠翠 陈娜 陈明娜
• 来源期刊: 花生学报
• 学科: 农学
• 关键词: 花生 黄曲霉毒素 序列分析 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告与简报
• 页码范围: 5-13
• 页数: 9页
• 分类号: S565.2|Q785
• 字数: 5712字
• 语种: 中文
• DOI: 10.14001/j.issn.1002-4093.2016.04.002

摘要

类花生致敏原3(iso-ARah3)是花生致敏原3的同系物,其表达活性与干旱及黄曲霉侵染相关.本研究通过RT-PCR技术从花生种子cDNA文库中克隆获得iso-ARah3的开放阅读框(ORF),全长1533bp,编码510个氨基酸,N端预测有20个氨基酸的信号肽序列.通过序列比对发现,该克隆序列有1处缺失突变,其N端210个氨基酸序列与胰蛋白酶抑制因子的同源性较高,达83.60%.通过构建原核表达载体pET28a-isoARah3,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,融合蛋白His-isoARah3获得高效表达,分子量约54kD.His-isoARah3经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的iso-ARah3多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比(1∶512000)很好的抗体.通过对融合蛋白的诱导前和纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示仅在纯化样品相应位置(54kD)有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性.本研究结果为深入研究花生iso-ARah3基因的功能奠定了基础.