shRNA沉默CBS基因的慢病毒载体构建及稳定转染PC12细胞系的建立

• 作者: 尹涵予 尹蔚兰 廖志强
• 来源期刊: 激光生物学报
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 PC12 胱硫醚-β-合成酶 转染 慢病毒
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 451-455
• 页数: 5页
• 分类号: Q78|R318
• 字数: 2712字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2016.05.011

摘要

目的：硫化氢是一种重要的气体信号分子，作为一种神经调质在神经系统中起重要作用。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是脑内硫化氢合成的主要酶。构建针对大鼠 CBS 基因的 shRNA 干扰载体，稳定转染 PC12细胞，观察该载体对 PC12细胞 CBS 基因的沉默效应。方法：构建三条针对大鼠 CBS 基因的 shRNA，经前期实验筛序一条最有效靶点与载体 GV248（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）连接，经转化及 PCR 阳性克隆筛选及测序鉴定。将 LV-CBS-ShRNA 慢病毒载体连同包装载体经脂质体2000共转染到293T 细胞，慢病毒包装后用荧光法进行滴度测定。将包装好的慢病毒转染到 PC12细胞，用嘌呤霉素进行筛选，得到稳定转染 LV-CBS ShRNA的 PC12细胞。实时荧光定量 PCR 检测 CBSmRNA 的表达，Western-blot 检测 CBS 蛋白的表达。结果：PCR 扩增和测序结果证明，成功构建大鼠 LV-CBS ShRNA 慢病毒载体，经包装产生的慢病毒滴度为1×109 TU ／mL。与转染阴性对照慢病毒（LV-NC-ShRNA）的细胞比较，LV-CBS ShRNA 慢病毒转染可使 PC12的 CBSmRNA 和 CBS 蛋白表达分别下降51．2％和48％。成功构建 CBS 基因 ShRNA 干扰的 PC12细胞株，为后续研究 CBS 在神经系统中的作用奠定基础。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	廖志强	南华大学医学院临床医学系	2	0	0.0	0.0
2	尹涵予		1	0	0.0	0.0