汉坦病毒Hunan03株S基因克隆、表达及核蛋白免疫原性分析

• 作者: 何方玲 刘佳惠 刘建高 张红 李俊华 蔡亮 覃迪 邹义洲 高立冬
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 关键词: 汉坦病毒 S基因 原核表达 核蛋白免疫原性
• 年，卷（期）: 2016,（8）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 711-716
• 页数: 6页
• 字数: 5071字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.006

摘要

目的 构建汉坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中进行核蛋白表达,研究核蛋白的免疫性及免疫反应性.方法 设计特异性扩增汉坦病毒Hunan03株S基因完整开放阅读框(ORF)的引物,RT-PCR扩增,产物克隆到pGM T载体,转化感受态细胞TOP10,应用蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,转化Ecoli.BL21 StarTM(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot对重组蛋白进行鉴定.应用Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,建立间接ELISA法对核蛋白的免疫原性与免疫反应性进行评价.结果 PCR扩增S基因ORF区域产物大小约1 306 bp,重组载体pGEX-6p-2-S经双酶切、PCR、测序鉴定提示构建成功;在37℃,IPTG浓度为0.8 mmol/L诱导5h的条件下,表达出最高量的相对分子量约74 kDa的GST-NP融合蛋白.建立的间接ELISA法检测GST-NP融合蛋白免疫后的新西兰兔血清,IgM抗体滴度达1∶8 000,IgG抗体滴度达1∶16 000.结论 成功构建了高效表达的汉坦病毒S基因重组表达载体,获得了纯度较高具有较好的免疫原性与免疫反应性的核蛋白,为后续汉坦病毒单克隆抗体的制备奠定了基础.