RNA解螺旋酶A表达系统的探究及其动力学研究

• 作者: 刘斐 刘红蕊 单衍可 吴诚诚 孙海凤 施志玉 谢青云 邢刚 雷静
• 来源期刊: 南京农业大学学报
• 学科: 农学
• 关键词: RNA helicase A 大肠杆菌表达系统 杆状病毒表达系统 温度 pH 分子机制
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 页码范围: 831-837
• 分类号: S852.23
• 语种: 中文
• DOI: 10.7685/jnau.201511048

摘要

[目的]RNA解螺旋酶A(RNA helicase A,RHA)参与许多细胞生物学过程中,并能促进爱滋病病毒1型(HIV-1)等一些病毒的复制,本试验旨在探究温度、pH值对RHA的动力学影响.[方法]利用PCR扩增全长RHA基因,构建重组载体pET-28a-RHA和pCold-Ⅰ-RHA,分别转化至BL21 star(DE3)和BL21、Rosetta2菌株中,加IPTG分别在28℃和15℃中诱导表达.将全长RHA基因重组到pFastBae Dual载体中,然后将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,通过转座作用,将RHA基因整合到杆状病毒基因组中.提取重组杆状病毒基因组(重组杆粒DNA),将重组杆粒DNA转染到sf9细胞中,收集细胞,纯化蛋白,可以得到完整的RHA.建立体外解螺旋反应体系,改变温度、pH值,检测RHA活性的变化.[结果]完整RHA在BL21、Rosetta2中可微量可溶表达.sf9可以表达有活性的完整RHA.反应温度降低时,解螺旋速率变小,RHA活性降低.pH值在6.5～8.0范围内,随着pH值升高,RHA活性升高;当pH值大于8.0时,RHA活性降低.[结论]完整的RHA在BL21、Rosetta2中可微量表达;有3'-tailed解旋极性的RHA活性受温度、pH影响较大.