人基质金属蛋白酶3基因RNA慢病毒载体构建及在人退变髓核细胞中的鉴定

• 作者: 位华卫 傅培荣 房晶 曹进 李思源 杨建坤 西永明 高峰
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 软骨组织工程 基质金属蛋白酶3 RNA干扰 慢病毒 髓核细胞 椎间盘退变 基因转染 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2016,（7）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建细胞学实验
• 页码范围: 947-956
• 页数: 10页
• 分类号: R318
• 字数: 2049字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.005

摘要

背景：抑制椎间盘细胞外基质的降解可以延缓椎间盘退变的进程，基质金属蛋白酶3是降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖细胞外基质成分的关键酶。<br>　　目的：构建人基质金属蛋白酶3特异性shRNA 重组慢病毒载体，感染人退变的髓核细胞，鉴定干扰效果。<br>　　方法：根据基质金属蛋白酶3基因mRNA序列，设计4组靶向基质金属蛋白酶3基因的短发夹RNA序列，合成、退火形成双链DNA片段，与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞，对长出的克隆进行菌落 PCR 鉴定，并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。用慢病毒质粒载体感染人退变的髓核细胞，荧光显微镜观察感染率，在72和96 h使用实时PCR和Western blot检测干扰效果。<br>　　结果与结论：①酶切和测序两种方法结果证明4种质粒载体的插入序列完全正确，慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为(1-5)×108TU/mL。②含有GCC AGG CTT TCC CAA GCA AAT干扰序列的干扰效率最高，72和96 h基质金属蛋白酶3基因表达水平干扰分别为98%和72%，96 h基质金属蛋白酶3蛋白水平干扰57.2%。③实验成功构建了靶向人基质金属蛋白酶3基因RNA干扰慢病毒载体，为进一步研究基质金属蛋白酶3功能和用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	房晶	青岛大学附属医院脊柱外科	8	18	3.0	4.0
2	傅培荣	青岛大学附属医院脊柱外科	19	43	3.0	6.0
3	高峰	青岛大学附属医院脊柱外科	8	13	2.0	3.0
4	李思源	青岛大学附属医院脊柱外科	7	14	2.0	3.0
5	曹进	青岛大学附属医院脊柱外科	1	1	1.0	1.0
6	杨建坤	青岛大学附属医院脊柱外科	1	1	1.0	1.0
7	位华卫	青岛大学附属医院脊柱外科	1	1	1.0	1.0