同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR（Arm-PCR）方法的建立和应用

• 作者: 史成银 李晋 王胜强 粟子丹 耿伟光
• 来源期刊: 渔业科学进展
• 学科: 农学
• 关键词: 鱼类病毒 多重检测 高通量 多重PCR
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 128-134
• 页数: 7页
• 分类号: S943
• 字数: 4554字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11758/yykxjz.20150606001

摘要

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原，危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测，本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上，设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物，并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化，结合基因芯片检测技术，建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为：Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl，10×PCR Buffer(含20 mmol/L的Mg2+)5μl，dNTP(各2.5 mmol/L)5μl，10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl，模板1μl，ddH2O补足至50μl，退火温度为56℃。研究结果显示，该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测，检测灵敏度分别为101 copies/μl (RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、102 copies/μl (LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和103 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒，TRBIV)。该方法特异性强，与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势，能有效提高工作效率，在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。