茶尺蠖水通道蛋白EoAQP1的cDNA克隆、多克隆抗体制备及亚细胞定位

• 作者: 刘丰静 吴光远 张辉 李慧玲 李良德 王定锋
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 茶尺蠖 水通道蛋白 克隆 生物信息学 表达模式 亚细胞定位 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 382-391
• 分类号: Q966
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2016.04.003

摘要

[目的] 水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用.本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布.[方法] 采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证.[结果] 克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为EoAQP1(GenBank登录号:KT819587),EoAQP1 cDNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸.系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,EoAQP1在鳞翅目昆虫中高度保守.跨膜结构和水分渗透模拟表明,EoAQP1具有经典的水分渗透模型.qRT-PCR结果表明,EoAQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著.亚细胞定位结果表明,EoAQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达.多克隆抗体Western blot检测结果表明,EoAQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验.[结论] 获得了EoAQP1的cDNA序列,明确了EoAQP1的生物学特征,阐明了EoAQP1的时空表达特性,成功制备了EoAQP1多克隆抗体,初步了解了EoAQP1的亚细胞定位,为进一步研究EoAQP1的水分渗透机理奠定了分子基础.