SPF 鸡胚 St3galⅠ基因的克隆及其在 MDCK 细胞中的表达

• 作者: 吴信明 张松林 李树芳 沈志强 管宇 陆玉建 韩文瑜
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 唾液酸 St3galⅠ 基因 MDCK 转染 G418 PCR
• 年，卷（期）: 2016,（2）
• 页码范围: 45-51
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 5528字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7668/hbnxb.2016.02.009

摘要

为了提高 MDCK 细胞表面禽流感病毒（AIV）受体的水平，以12日龄的 SPF 鸡胚为试材，通过反转录 PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因（St3galⅠ），并将回收的片段插入到 pMD18-T 载体中。酶切 pMD18-T-St3galⅠ和 pCI-neo质粒，将目的片段进行连接，构建含有 St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染 MDCK 细胞，在 G418的筛选下，获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和 PCR 检测，筛选可稳定表达 St3galⅠ基因的细胞株。结果表明，从鸡胚中克隆的 St3galⅠ基因成功的插入到 pCI-neo 质粒，从而实现真核表达载体 pCI-neo-St3galⅠ的构建。在 G418选择压力下，初步获得了稳转目的基因的 MDCK 细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释，经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组 DNA 和总 RNA 为模板，经 PCR 检测显示，目的基因已整合入MDCK 细胞的基因组中并可稳定的进行表达。