建立pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒和脂质体介导转染原代培养新生猪AEC-Ⅱ方法

• 作者: 孙波 徐艳
• 来源期刊: 中华急诊医学杂志
• 关键词: 肺泡Ⅱ型上皮细胞 原代培养 pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒 转染
• 年，卷（期）: 2016,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 50-56
• 页数: 7页
• 字数: 5674字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2016.01.012

摘要

目的 构建pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒,利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)中,为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础.方法 应用含人TGF-β1 CDS的质粒,设计PCR引物扩增出其CDS片段,将其与空质粒pEGFP-N1用XhoI和EcoRI双酶切,T4 DNA Ligase连接双酶切产物,将连接产物转化入DH5α中,培养16 h后抽提质粒,PCR法鉴定和测序证实TGF-β1 CDS序列正确.采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染,将新生猪AEC-Ⅱ原代培养48 h至细胞融合80％ ～ 90％,换为无血清培养液;将质粒DNA(pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒)和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀,置于培养箱中培养4～6h,更换为完全培养液;转染24～48 h后,荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平.结果 PCR法及测序鉴定证实TGF-β1 CDS序列正确,重组质粒构建成功,采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195.5 μg/mL,转染后48 h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达,证实已将其成功转染入原代培养的AEC-Ⅱ中.结论 成功构建了pEGFP-N1-TGF-β1真核表达载体,并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC-Ⅱ中,为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孙波	复旦大学附属儿科医院小儿呼吸与危重病实验室	86	650	12.0	22.0
2	徐艳	复旦大学附属儿科医院小儿呼吸与危重病实验室	27	79	5.0	8.0