Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

• 作者: 刁勇 周国华 宋沁馨 杨会勇 滕继云 王立强 饶华春
• 来源期刊: 厦门大学学报（自然科学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: Tm值差异型不对称PCR 单链DNA模板 单核苷酸多态性 焦磷酸测序 禽流感病毒
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 485-494
• 页数: 10页
• 分类号: Q755
• 字数: 6115字
• 语种: 中文
• DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201506017

摘要

多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链 DNA 为基础的,如何获得大量和高质量的单链靶 DNA 分子一直是研究热点。以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的 DNA 片段为研究对象,通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5'-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid,LNA)),使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异,改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液,不同退火温度的二阶循环扩增程序)后,进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物。结果表明Tm差异型不对称 PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率,降低引物设计难度,也扩大了模板序列的适用范围。此外,还针对禽流感病毒 H5N1的血凝素(haemag-glutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增,用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测,所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号。因此,采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高,具有很好的通用性和实用性。