胆道闭锁循环miRNA的高通量测序分析

• 作者: 付捷 庞舒尹 彭小芳 杨丽媛 温哲 辜少玲 陈奕豪 陈峥嵘 高坎坎
• 来源期刊: 中华小儿外科杂志
• 关键词: 胆道闭锁 微RNAs 高通量测序 标记物,DNA
• 年，卷（期）: 2016,（11）
• 所属期刊栏目: 肝胆外科专题
• 页码范围: 815-822
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2016.11.004

摘要

目的 用高通量二代测序方法(next generation sequencing,NGS)分析胆道闭锁(biliary atresia,BA)患儿外周血中循环miRNA的表达特征,为寻找新的疾病相关无创诊断标志物提供依据.方法 分别收集2013年1月至2014年5月到本中心就诊的29例BA(疾病组),10例婴儿肝炎综合征、5例Citrin基因缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)、5例胆总管囊肿(疾病对照组)和29例健康对照(正常对照组)血浆样本.选取前期收集的疾病组和正常对照组样本各9例用于高通量测序,将两组儿童分别按性别和年龄匹配分为3组,将血浆样本按上述分组进行组内等比例混合,提取血浆混合池中的总RNA,以Illumina HiSeq 2000测序仪分析混合样品中的全部miRNA序列.组间差异比较采用t检验,靶基因预测软件TargetScan,miRanda和PITA对差异miRNA的功能进行预测;并以实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)对差异表达显著的miRNA进行验证.结果 本研究成功构建BA患儿循环miRNA表达谱;BA患儿组与正常对照组中有188个循环miRNA表达存在差异(P＜0.05),包括87个上调、101个下调,56个为新发现的miRNA,其余皆为数据库中的已知miRNA.表达差异大于2倍的miRNA有146个,77个上调、69个下调.其中,表达量高且为各样本组恒定表达的miRNA有8个,均为已知miRNA,包括上调的has-miR-122-5p、-100-5p、-432-5p,下调的has-miR-140-3p、-10b-5p、-26a-5p、-126-3p、-744-5p;功能预测显示,这8个差异miRNA与肝胆发育、肝纤维化、细胞凋亡等相关;RT-qPCR验证结果表明,BA组血浆hsa-miR-122-5p、-100-5p表达量显著高于正常对照,而hsa-miR-140-3p、-10b-5p、-126-3p显著低于正常对照组(均P＜0.05),与测序结果一致.结论 本研究结果全面展示了BA患儿外周血循环中miRNA的表达特征,其中一些差异性的miRNA有可能作为BA无创性诊断的候选标志物.