H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立

• 作者: 吴彤 吴文学 蒋菲 闫新博 黄书林
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP) H5亚型禽流感病毒(H5-AIV) 冻干 RT-PCR 显色
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 1384-1391
• 分类号: S855.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.09.012

摘要

本研究利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)检测方法.首先,针对H5亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因8个保守区域设计了3对扩增引物.然后,添加到RT-LAMP反应体系中,并加入优选的冻干保护剂进行冷冻干燥.取等温扩增冻干试剂,用双蒸水溶解并恢复至原体积后,在63℃反应lh,可检出102拷贝的目的基因,比RT-PCR方法敏感约10倍,并且证明冷冻干燥对等温扩增反应敏感性没有影响.另外,利用等温扩增冻干试剂对禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行检测,结果显示特异性良好.为了便于临床应用,在反应结束后加入由SYBR Green Ⅰ与羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)组成的显色液,可通过肉眼观察颜色变化判定RT-LAMP结果,与琼脂糖凝胶电泳方法判定结果一致.为考察等温扩增冻干试剂的临床应用效果,对326份临床样品进行了检测.结果表明,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为38份和31份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR方法.因此,本研究建立的H5亚型流感病毒RT-LAMP反应体系,可以冻干处理并经显色观察结果,便于研制成试剂盒产品,其敏感性高、特异性好、操作简捷,利于在基层兽医实验室和养殖场推广应用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	蒋菲	中国农业大学动物医学院	7	104	6.0	7.0
2	黄书林	中国农业大学动物医学院	7	112	6.0	7.0
3	吴文学	中国农业大学动物医学院	29	418	10.0	20.0
4	吴彤	南京农业大学生命科学学院	5	13	2.0	3.0
5	闫新博	中国农业大学动物医学院	3	9	2.0	3.0