基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测

• 作者: 张冰 张荣光 杨海燕 梁文娟 段广才 洪丽娟 王颖芳 王鹏飞 郗园林
• 来源期刊: 西安交通大学学报（医学版）
• 关键词: 大肠埃希菌O157∶H7 成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR) 聚合酶链反应 检测
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 技术方法研究
• 页码范围: 748-753
• 页数: 6页
• 分类号: R37
• 语种: 中文
• DOI: 10.7652/jdyxb201605027

摘要

目的 基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法.方法 应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列.使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列.Clustal X软件进行间隔序列比对.比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性.结果 共分析543株肠道细菌,其中75.6％的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5％志贺菌、91.7％沙门菌和95％O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3.57.1％的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6％志贺菌、85.4％沙门菌和100％ O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个.95％的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90％ CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1,S1-2,S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1).间隔序列比对结果显示,S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100％和99.6％.标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6％和99.3％.基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3 CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来.大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类.结论 基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具.