水稻Os4CL5的Val337缺失突变激活其芥子酸催化活性

• 作者: 孙海燕 李朋朋 杨志刚 罗兵 赵敏欢
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 水稻 4-香豆酸:辅酶A连接酶 原核表达 酶活性
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1312-1318
• 分类号: Q71
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.09.004

摘要

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯,从而调控木质素和黄酮类物质的生成.4CL的芥子酸催化活性一直是备受关注的一个问题,目前只有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的At4CL4和大豆(Glycine max)的Gm4CL1具有芥子酸转化能力.本研究用水稻(Oryza sativa subsp.japonica)苗期的叶片为材料,提取总RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增水稻的Os4CL5基因,并将其连接到原核表达载体pET22-b(+)上,构建了原核表达载体pET-4CL5(+Val).通过定点突变的方法删除了水稻Os4CL5的Val337,构建了原核表达载体pET-4CL5(-Val).重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(ED3)并经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测表明,融合蛋白的分子量为57.0 kD,与预测值一致.His-SpinTrap蛋白纯化系统纯化回收重组蛋白,然后对重组蛋白的酶学性质进行表征.结果表明,野生型Os4CL5对不同底物表现出了不同的催化效率,香豆酸是最适底物,其次是阿魏酸,再次是咖啡酸,对芥子酸没有活性.与野生型Os4CL5相比,突变型Os4CL5对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸的催化效率有所提高,并且其底物特异性发生了明显改变,获得了对芥子酸的催化活性.本研究为利用基因工程手段调控木质素的生物合成提供了理论依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨志刚	常熟理工学院生物与食品工程学院	26	90	6.0	8.0
3	罗兵	常熟理工学院生物与食品工程学院	31	126	7.0	10.0
5	孙海燕	常熟理工学院生物与食品工程学院	32	127	7.0	10.0
11	赵敏欢	常熟理工学院生物与食品工程学院	1	1	1.0	1.0
12	李朋朋	常熟理工学院生物与食品工程学院	1	1	1.0	1.0