水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

• 作者: 余成鹏 刘琼光 陈雪凤
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 水稻基腐病菌 flhDC fliA 运动性 致病性
• 年，卷（期）: 2016,（24）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 4726-4734
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.24.005

摘要

[目的]水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一.细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flhDC和fliA基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略.论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flhDC和fliA在致病性中的作用.[方法]以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因fJhDC和fliA各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flhDC和fliA的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体pKNG101上,构建带有反向筛选标记基因sacB的自杀重组质粒pKNG-△lhDC和pKNG-△fliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flhDC和fliA缺失突变体△flhDC和△fliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16SrDNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法,比较野生菌和突变体△flhDC和△fliA下游基因flhD、flhC、fliA和fliC的表达量差异.[结果]通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体△flhDC和△fliA.表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株△flhDC和△fliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体△flhDC和△fliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体△flhDC和△fliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株△flhDC和△fliA显著降低了对水稻植株上的致病力.进一步的表型测定结果显示,突变体菌株△flhDC和△fliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异.qRT-PCR分析结果显示,在突变体菌株△flhDC中,flhD和lhC不表达,fliA和fliC的表达量较野生菌明显下降;而在突变体△fliA中,flhD、flhC和fliA均不表达,fliC表达明显下降.[结论]调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flhDC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ28基因fliA,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分.flhDC和fliA显著影响D.Zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用.