凝血因子Ⅸ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及其在HEK-293细胞的表达

• 作者: 康建民 张耀方 杨林花 王刚 王梅芳 秦秀玉 陈剑芳
• 来源期刊: 中华血液学杂志
• 关键词: 血友病B 因子Ⅸ 真核细胞 质粒
• 年，卷（期）: 2016,（11）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 971-975
• 页数: 5页
• 字数: 4153字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2016.11.009

摘要

目的 以含有凝血因子Ⅸ(FⅨ)cDNA的pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达.方法 以pcDNA/FⅨ质粒为模板,扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框(ORF)区,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定.野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞后,分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性.结果 成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并转染HEK-293细胞,实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨmRNA,激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成,野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为(92.03士0.29)％、(86.89±8.78)％,无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0.结论 成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨林花	山西医科大学第二医院血液科	222	741	13.0	16.0
2	陈剑芳	山西医科大学第二医院血液科	33	146	7.0	10.0
3	王梅芳	山西医科大学第二医院血液科	33	114	5.0	9.0
4	王刚	山西医科大学第二医院血液科	17	43	4.0	6.0
5	康建民	山西医科大学第二医院血液科	18	32	3.0	4.0
6	张耀方	山西医科大学第二医院血液科	23	54	5.0	5.0
7	秦秀玉	山西医科大学第二医院血液科	9	27	2.0	5.0