山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

• 作者: 史怀平 姚大为 朱江江 王苗 罗军 许会芬 赫秋亚
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 山羊乳腺上皮细胞 胰岛素诱导基因1 (INSIG1) 超表达 脂质合成
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 遗传繁育
• 页码范围: 1806-1816
• 页数: 11页
• 分类号: S827|S813.3
• 字数: 6696字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.008

摘要

本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1 (INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础.根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列.将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒Pine Ⅰ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体.该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度.将获得的重组腺病毒Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量.结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-i)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P＜0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGA T2的mRNA表达量显著下降(P＜0.05),AGPA T6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P＜0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化.综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用.