用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠 lncRNA-H19与 miR-199a-5p 的靶向关系

• 作者: 伍权华 侯婧瑛 吴浩 周长青 汪蕾 王彤 郑韶欣 郭天柱 钟婷婷 龙会宝
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 长链非编码RNA-H19 微小RNA-199a-5p 双萤光素酶报告基因
• 年，卷（期）: 2016,（12）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 2256-2260
• 页数: 5页
• 分类号: R363
• 字数: 2970字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2016.12.022

摘要

目的：构建长链非编码RNA-H19（ lncRNA-H19）萤光素酶报告质粒，利用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与微小RNA-199a-5p（miR-199a-5p）的靶向关系。方法：通过生物信息学网站RegRNA 2.0预测获取小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p潜在的互补结合位点。将H19及其突变体克隆到萤光素酶载体psiCHECK-2中，构建H19野生型和突变型质粒，并采用酶切和测序方法鉴定psiCHECK-2-H19载体是否构建成功。将H19野生型和突变型质粒分别与miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p 模拟物阴性对照或miR-199a-5p抑制剂阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性，从而对lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向调节关系进行验证。结果：构建的重组萤光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确，双萤光素酶报告基因检测显示，与miR-199a-5p模拟物阴性对照组相比，miR-199a-5p模拟物组H19野生型报告基因的萤光素酶活性显著降低，下降约49％左右（P＜0.01），而miR-199a-5p 抑制剂组H19野生型报告基因的萤光素酶活性较miR-199a-5p模拟物组明显增高（P＜0.01）。 miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照以及miR-199a-5p 抑制剂阴性对照对H19突变型的萤光素酶活性均无明显影响。结论：lncRNA-H19能够靶向结合miR-199a-5p，并在转录后水平对其有直接抑制作用。