肠出血性大肠杆菌O157∶H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

• 作者: 刘迎春 夏灿 孙卫东 王权 蒋蔚 薛俊欣 陈永军 龙梦瑶
• 来源期刊: 畜牧与兽医
• 学科: 农学
• 关键词: 肠出血性大肠杆菌 O157∶ H7 三重荧光定量PCR 毒力基因 Taqman探针
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 试验研究
• 页码范围: 13-21
• 页数: 9页
• 分类号: S855.1
• 字数: 5695字
• 语种: 中文

摘要

根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的菌体抗原基因rfbE、鞭毛抗原基因fliC、溶血素基因hlyA、紧密黏附素基因eaeA和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfbE/eaeA、Stxl/hlyA、fliC/Stx2探针5’端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3’端均标记为BHQ1荧光淬灭基团.通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157∶H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法.结果显示,该方法灵敏度高,stxl、rfbE、fliC、eaeA、hlyA、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2％;检测过程耗时约1h.将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8h后测得大肠杆菌O157∶H7的最低检出限分别为200 cfu/mL与1 cfu/mL.以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其毒力基因的方法.