同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

• 作者: 何凡 刘志昕 张治礼 李向宏 罗志文 胡加谊 胡福初 范鸿雁
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 农学
• 关键词: 菠萝凋萎病 检测方法 实时荧光定量RT-PCR PMWaV TaqMan探针
• 年，卷（期）: 2017,（2）
• 页码范围: 38-44
• 页数: 7页
• 分类号: S432.4|Q78
• 字数: 5518字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7668/hbnxb.2017.02.003

摘要

目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3).通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段.根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和TaqMan水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR检测方法.其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验.灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%.这表明建立的三重RT-qPCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础.