缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响

• 作者: 吴军 徐正东 李海胜 王淞 罗高兴 贺伟峰
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 缺氧诱导因子1 细胞迁移分析 伤口愈合 表皮干细胞 P311
• 年，卷（期）: 2017,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 287-294
• 页数: 8页
• 字数: 6661字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.007

摘要

目的 体外条件下模拟缺氧环境,探讨P311和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)相互作用及对小鼠表皮干细胞(ESC)迁移影响. 方法 取15只C57BL/6J野生型新生小鼠,5只同属来源P311基因敲除新生小鼠,分离培养2种小鼠ESC,取第1代细胞行形态学观察,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验.(1)取2种小鼠ESC划痕处理后,立即按随机数字表法(下同)将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组(将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养,常氧处理下同)和缺氧组(将细胞置于含体积分数1％氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养,缺氧处理下同),每组12个插件;将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜(DMSO)对照组(用2 μL DMSO溶剂常氧处理1h后行缺氧培养)、HIF-1α抑制剂组(加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2μL常氧培养1h后行缺氧培养)、HIF-1α稳定剂组(加入2μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1h后行缺氧培养),每组12个插件.每组各时相点取3个插件分别于划痕后0(即刻)、12、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度.(2)取野生型小鼠ESC行缺氧培养,蛋白质印迹法检测缺氧0(即刻)、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达.(3)取野生型小鼠ESC同实验(1)分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理,分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达,免疫细胞化学染色法观测P311表达(样本数均为12).(4)取第2代人胚胎肾293(HEK-293)细胞分为空载缺氧组(转染空载质粒后进行缺氧培养)、P311常氧组(转染P311报告基因质粒后进行常氧培养)、P311缺氧组(转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组(HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养),分别于培养0、12h检测荧光素酶活性,采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bon-ferroni校正. 结果 (1)ESC结果.细胞呈现铺路石样改变,细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态.CD71-CD49f+细胞占85％左右,说明ESC的干性较强、纯度较高.与P311基因敲除小鼠常氧组比较,单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05).与野生型小鼠常氧组比较,缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P＜0.05).与单纯缺氧组比较,缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大(P值均小于0.05),HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12h划痕剩余宽度较大(P＜0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05).7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显(F=19.02,P＞0.05).野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03.与缺氧0h比较,HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加(P＜0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P＜0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P＞0.05).与单纯缺氧组比较,HIF-1 α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311mRNA表达量均明显升高(P值均小于0.05).与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).与HIF-1 α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).(2)HEK-293细胞结果.培养0h,空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(F=13.33,P＞0.05).培养12h,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较空载缺氧组高(P＜0.01);P311缺氧组细胞荧光素酶活性较P311常氧组高(P＜0.05);P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性较P311缺氧组低(P＜0.01). 结论 缺氧早期,HIF-1α可能通过诱导P311表达促进小鼠ESC迁移.