苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及功能分析

• 作者: 冀志蕊 周宗山 张俊祥 徐成楠 王娜 迟福梅
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 衔接蛋白 果胶酶 苹果 炭疽菌 致病力
• 年，卷（期）: 2017,（8）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1430-1439
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.007

摘要

[目的]明确衔接蛋白(adaptor protein) GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingula ta)生长发育和致病过程中的功能,检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式,并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶(pectin lyase)基因pn1-1和pn10以及果胶酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pe1A和pe 1B的表达,为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径中的分子机制研究打下基础.[方法]通过构建GcAP1β基因敲除载体和GcAP1β-gf融合表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)获得△gcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株△gcap1 β-GcAP1β,并由RT-PCR和Southern杂交分析进行鉴定.以野生型菌株W16为对照,对△gcap1β突变体和GcAP1 β恢复菌株△ gcap1 β-GcAP1β的生长速度、产孢能力、分生孢子萌发率及附着胞形成率和致病性进行测定.利用生物信息学软件ProtComp 9.0和TMHMM对GcAP1β蛋白进行结构分析,并结合GcAP1 β-GFP信号观测,进行GcAP1β的亚细胞定位.利用qRT-PCR技术,检测GcAP1β在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染阶段的表达量,并检测CgPG1、CgPG2、pn1-1、ph1-2、pe1A和pe1B在野生型菌株和△gcap1β突变体中的表达量.[结果]GcAP1β基因全长2 321bp,含有3个内含子,编码720个氨基酸.与野生型菌株W16相比,△gcap1β突变体菌落成褶皱状,菌丝生长速度明显减慢,而分生孢子产量、分生孢子萌发率、附着胞形成率无显著差异.△gcap1β致病力明显降低,仅在苹果叶片上引起极小的点状斑.GcAP1β基因恢复菌株△gcap1 β-GcAP1β完全修复了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷.荧光检测显示,融合蛋白GcAP1 β-GFP分布于细胞质中.qRT-PCR检测结果表明,GcAP1β在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达,且在侵染后表达量相对最高.GcAP1β的缺失导致CgPG1表达量降低至20.3％,CgPG2表达量降低至16.5％,pn1-1表达量降低至8.2％,pn1-2表达量降低至14.4％,pe1A表达量降低至4.4％,pe1B表达量降至0.8％.[结论]衔接蛋白GcAP1复合体分布于细胞质中,是苹果炭疽叶枯病菌生长发育所需要的;GcAP1调控CgPG1、CgPG2、pn1-1、pn1-2、pe1A和pe1B的表达,是苹果炭疽叶枯病菌一个重要的毒力因子.