利用Red/ET同源重组构建新型CCR5Δ32打靶载体

• 作者: 丁妍 于莉 卢智勇 李东升 杨卓顺 王小莉 袁雅红
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 细菌人工染色体 CCR5 同源重组 重组工程
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 415-421
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 5365字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.003

摘要

目的:目前应用TALENs或CRISPR-Cas基因编辑技术修饰CCR5基因以获得抗HIV功能的研究策略基本是破坏CCR5基因而不是制造CCR5Δ32这样天然存在的抗HIV基因型.为此,我们尝试通过细菌内同源重组技术构建一个新颖的CCR5Δ32的打靶载体,以便能够用于制备CCR5Δ32基因突变细胞系.方法:首先利用Red/ET同源重组系统将rpsl-neo片段插入细菌人工染色体(BAC)的CCR5基因中,随后再次利用同源重组将一个不含32 bp区域的非选择性52 bp片段替换该rpsl-neo片段,从而将BAC中的CCR5基因改造成CCR5Δ32基因型,最后将loxp-neo-loxp抗性基因插入CCR5基因的第2内含子区域,制备出含有抗性基因的CCR5Δ32打靶载体,该载体可在Cre酶作用下删除neo基因但只留下一个loxp在基因的内含子区.结果:rpsl-neo片段成功插入CCR5之Δ32区并为非选择性52 bp片段替换,loxp-neo-loxp成功插入内含子区.结论:通过Red/ET同源重组技术获得CCR5A 32-loxp-neo-loxp打靶载体.