鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

• 作者: 仲建锋 刘媛 刘贤金 张存政 张霄 徐重新 林曼曼 胡晓丹 董飒
• 来源期刊: 江苏农业学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 噬菌体展示库 单链抗体 重叠延伸PCR 噬菌粒载体 Bt毒素
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 加工贮藏·质量安全
• 页码范围: 210-217
• 页数: 8页
• 分类号: Q936
• 字数: 3968字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4440.2017.01.034

摘要

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料.从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因.采用重叠延伸PCR (SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库.以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性.以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性.经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76 μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上.经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因.电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×108.随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性.以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强.