绿盲蝽磷脂酶C(AlPLC)的表达、纯化及酶学性质

• 作者: 姜义平 孙洋 柏立新 肖留斌 谭永安 赵旭东 赵静 郝德君
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 绿盲蝽 磷脂酶C 原核表达 蛋白纯化 酶学特性 酶活性
• 年，卷（期）: 2017,（11）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 1247-1254
• 页数: 8页
• 分类号: Q966
• 字数: 6729字
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2017.11.002

摘要

[目的]本文在前期获得绿盲蝽Apolygus lucorum磷脂酶C基因(AlPLC)的基础上,明晰AlPLC基因在绿盲蝽不同日龄若虫中的表达特征,阐明AlPLC重组蛋白的酶学性质.[方法]qRT-PCR法分析1-13日龄绿盲蝽若虫AlPLC的表达量;构建含有AlPLC基因的原核表达载体pCzn1-AlPLC;进一步将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白纯化,获得具有磷脂酶活性的重组蛋白;以p-NPPC(P-硝基苯基磷酸胆碱)为底物测定不同温度和不同pH下的重组AlPLC蛋白酶活性,最终确定了其酶活性的最佳pH和最适温度.[结果]AlPLC mRNA在绿盲蝽测定的若虫期持续表达,在4,8,12以及13日龄若虫中表达量相对较高.重组蛋白AlPLC可在大肠杆菌Escherichia coli中表达一个约79 kD的蛋白,12％ SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在;经过变性,复性获得具有磷脂酶活性的纯化蛋白.在蛋白浓度为0.25 mg/mL条件下,该酶最适温度为57℃(179.54±3.96 nmol/μg·min),最适pH为8.5(374.99±2.84 nmol/μg·min).[结论]结果表明AlPLC在绿盲蝽若虫中表达具有特异的发育历期特性,获得的重组蛋白在较高温度和碱性环境下有较高磷脂酶活性.本研究结果为后续在蛋白水平上解析AlPLC的功能奠定基础.