人呼吸道合胞病毒FHRA-HRB片段的表达纯化与鉴定

• 作者: 唐维 夏超 易善泽 李满妹 李药兰 沈良华 牛得伟 王峰
• 来源期刊: 暨南大学学报（自然科学与医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 呼吸道合胞病毒 FHRA-HRB片段 载体构建 蛋白表达
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 页码范围: 301-307
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 4459字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11778/j.jdxb.2017.04.004

摘要

目的: 克隆呼吸道合胞病毒融合F蛋白(RSV-F)中FHRA-HRB基因片段,构建体外的原核表达载体,对FHRA-HRB蛋白进行表达纯化,为进一步研究FHRA-HRB蛋白构效关系及抗RSV活性提供实验依据.方法: 用Trizol法从RSV感染的Hep-2细胞中提取病毒RNA,逆转录得cDNA,使用Primer 6.0软件设计特异性引物,聚合酶链反应(PCR)扩增得到FHRA-HRB片段,测序成功后,将FHRA-HRB 插入pET-15b脱磷载体中,转化入Rosetta-gami表达宿主,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导FHRA-HRB的体外表达,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白.用Western-blot法鉴定FHRA-HRB蛋白表达.结果: 成功扩增了大小约1100 bp的FHRA-HRB片段,克隆进pET-15b载体后,菌液PCR验证与测序分析结果表明FHRA-HRB片段序列与预期一致且读码框插入正确,表达载体构建成功.工程菌经IPTG诱导后成功表达大小约43 000的FHRA-HRB蛋白,经Ni-NTA agarose纯化后FHRA-HRB蛋白纯度达95%以上.纯化后的FHRA-HRB蛋白经Western-blot鉴定其大小正确.结论: 成功构建pET-15b-FHRA-HRB表达载体,经表达纯化后,得到了纯度较高的FHRA-HRB蛋白,纯化蛋白经Western-blot鉴定正确.本研究为进一步研究其抗RSV活性和开发以F蛋白为靶点的抗RSV药物提供实验依据.