荧光MAPREC分析Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率方法的建立和应用

• 作者: 何蕊 张平 徐康维 李长贵 王剑锋 英志芳 赵慧 魏文明
• 来源期刊: 微生物学免疫学进展
• 学科: 医学
• 关键词: 聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析 脊髓灰质炎病毒 疫苗 荧光标记 突变率
• 年，卷（期）: 2017,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 56-60
• 页数: 5页
• 分类号: R373.2+2
• 字数: 2665字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2017.06.009

摘要

目的 使用CY5荧光标记引物建立定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MA-PREC.方法 提取Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒样品RNA,反转录合成cDNA后,进行非对称PCR扩增以生成单链DNA,之后采用CY5荧光标记引物进行一步扩增反应以合成双链产物,以DNA内切酶Dde Ⅰ和Nci Ⅰ酶切后电泳分离,获取荧光信号,计算样品的突变率.检测4个国际标准品(100％ DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品和HMVR标准品)的突变率,重复5次,验证方法的准确性和精密度,并进行初步应用.结果 使用CY5荧光标记引物,建立了定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MAPREC.100％ DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100.00％、2.00％、1.84％、2.56％,检测结果分别为95.09％、2.06％、1.45％、1.92％,各标准品的实验间CV值均＜15％.Ⅰ型Sabin株口服脊髓灰质炎减毒活疫苗工作种子、单次收获液和原液的突变率为1.05％～1.22％,批间一致性良好.结论 初步建立了基于荧光素标记的MAPREC,可以代替同位素法进行Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率的定量检测.