小菜蛾中肠Polycalin蛋白的基因克隆、表达及与Cry1Ac毒素的结合特性分析

• 作者: 刘同先 孙聪 展恩玲 李怡萍 杜潇 赵爱平
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 小菜蛾 Bt毒素 Polycalin 基因克隆 基因表达 Cry1Ac毒素
• 年，卷（期）: 2017,（10）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 1155-1167
• 页数: 13页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2017.10.006

摘要

[目的]Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关.本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylosteUa Polycalin蛋白与Bt Cry1 Ac毒素的关系.[方法]本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1 Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量.提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性.[结果]克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征.该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1 Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1 Ac毒素浓度越高,下降越明显.通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1 Ac毒素结合.[结论]本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值.