绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

• 作者: 孙洋 柏立新 肖留斌 谭永安 赵旭东 赵静 郝德君
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 绿盲蝽 AlE75D 基因克隆 表达谱 原核表达 单克隆抗体
• 年，卷（期）: 2017,（9）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 984-993
• 页数: 10页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2017.09.002

摘要

[目的]克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体.[方法]利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因AlE75D全长;qRT-PCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用Nde Ⅰ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的pMD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性.[结果]从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因AlE75D(GenBank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 kD;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190 aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽AlE75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98％).AlE75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,AlE75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达.双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,IPTG可成功诱导pCzn1-AlE75D重组质粒特异性表达一个约75 kD的蛋白.用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗AlE75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及AlE75D重组蛋白特异性结合.[结论]AlE75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性.结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	肖留斌	江苏省农业科学院植物保护研究所	44	434	12.0	17.0
2	柏立新	江苏省农业科学院植物保护研究所	68	747	15.0	22.0
3	孙洋	江苏省农业科学院植物保护研究所	16	121	7.0	10.0
4	赵静	江苏省农业科学院植物保护研究所	7	29	3.0	5.0
5	谭永安	南京林业大学南方现代林业协同创新中心	1	0	0.0	0.0
9	赵旭东	南京林业大学南方现代林业协同创新中心	2	14	1.0	2.0