应用DPO技术检测番茄斑萎病毒方法的建立

• 作者: 刘忠梅 刘洪义 李丹丹 潘仲乐 罗佳 韩政坤 马微 魏冬旭
• 来源期刊: 河南农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 番茄斑萎病毒 双启动寡核苷酸引物 DPO-PCR 检测
• 年，卷（期）: 2017,（11）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 93-97
• 页数: 5页
• 分类号: S432.4+1
• 字数: 3623字
• 语种: 中文
• DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2017.11.016

摘要

为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术,以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因,设计了一对DPO引物,对PCR反应体系中的引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化,建立了TSWV的DPO-PCR检测方法,并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价.结果表明,应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带,与预期目标相符.经过优化后,DPO-PCR反应体系(25 μL)为:DNA模板1μL,10×Buffer(含Mg2)2.5 μL,dNTPs(每种2.5 mmol/L)2.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL,以去离子水补充至25 μL.利用该检测方法,在49.8 ～ 70.0℃的退火温度范围内,均可实现目标基因片段的高效扩增,说明其对退火温度不敏感;利用病毒RNA进行检测,该方法的灵敏度为7.5 ng;通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明,仅TSWV呈现阳性反应,说明该方法特异性强.所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV,可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断.