shRNA干扰富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5对结直肠癌肿瘤干细胞恶性行为的影响及其作用机制

• 作者: 侯松林 冷政伟 刘佳嘉 李敬东 王斯斯 石刚 石国露 肖云峰
• 来源期刊: 中华消化外科杂志
• 关键词: 结直肠肿瘤 肿瘤干细胞 自我更新 Wnt/β-catenin通路
• 年，卷（期）: 2017,（12）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1236-1241
• 页数: 6页
• 字数: 3651字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2017.12.013

摘要

目的 探讨shRNA干扰富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达对结直肠癌肿瘤干细胞(CSCs)恶性行为的影响及其作用机制.方法 采用实验研究方法.流式细胞术分选Lgr5+结直肠癌CSCs,转染shLgr5慢病毒载体设为实验组;转染相应对照病毒,设为对照组.流式细胞术检测Lgr5+细胞比例,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Lgr5 mRNA的相对表达量;成球实验检测细胞自我更新能力变化;平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验分别检测体内外成瘤能力变化;qRT-PCR检测细胞中干细胞基因(Oct4、Sox2、Nanog、KLF4)、CSCs基因(CD133、CD44、ALDH)及Wnt/β-catenin信号通路关键基因(Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1) mRNA表达变化.正态分布的计量资料以-x±s表示,组间比较采用t检验.结果 (1) shRNA慢病毒介导转染效率,流式细胞术检测结果显示:实验组Lgr5+细胞为6.8％±1.0％,对照组为92.7％±3.3％,两组比较,差异有统计学意义(t=43.148,P＜0.05).qRT-PCR检测两组CSCs中Lgr5 mRNA相对表达量:实验组和对照组分别为0.168±0.057和1.148±0.004,两组比较,差异有统计学意义(t=28.778,P＜0.05).(2) Lgr5下调对结直肠癌CSCs成球和成瘤能力的影响,成球实验结果显示:实验组和对照组成球数量分别为(29±6)个和(410±10)个,两组比较,差异有统计学意义(t=41.070,P＜0.05).平板克隆成瘤实验结果显示:实验组和对照组克隆成瘤数量分别为(72±4)个和(412±19)个,两组比较,差异有统计学意义(t=31.433,P＜0.05).裸鼠皮下成瘤实验结果显示:实验组和对照组裸鼠肿瘤体积分别为(81±15)mm3和(328±24) mm3,两组比较,差异有统计学意义(t=11.304,P＜0.05).(3) Lgr5下调对相关基因的影响,qRT-PCR检测结果显示:①实验组结直肠癌CSCs中干细胞基因Oct4、Sox2、Nanog、KLF4 mRNA的相对表达量分别为0.377±0.093、0.662±0.104、3.591±0.300、0.425±0.091;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为1.957±0.026、2.137±0.015、5.831±0.165、1.536±0.014;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=23.079,22.261,8.446,19.186,P＜0.05).②实验组结直肠癌CSCs中CSCs基因CD133、CD44、ALDH mRNA相对表达量分别为1.490±0.155、5.535±0.487、1.640±0.039;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为2.488±0.061、9.908±0.332、5.718±0.292;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=8.170,9.667,27.849,P＜0.05).③实验组结直肠癌CSCs中Wnt/β-catenin通路相关基因Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1 mRNA相对表达量分别为1.592±0.267、0.528±0.138、2.153±0.078、1.480±0.064、0.248±0.128、1.492±0.025、0.658±0.095、1.647±0.087;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为3.651±0.224、2.570±0.093、2.301±0.157、1.636±0.058、1.415±0.080、2.610±0.159、2.480±0.123、3.432±0.273;两组结直肠癌CSCs中Axin2、Wnt5a、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1比较,差异均有统计学意义(t=7.316,15.332,12.649,12.320,14.831,9.063,P＜0.05).两组结直肠癌CSCs中Wnt3a、Fzd3比较,差异均无统计学意义(t=2.887,2.242,P＞0.05).结论 shRNA干扰结直肠癌CSCs中Lgr5表达后,细胞的恶性行为受到抑制,这种作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路活性发挥生物学效应.