MiR-145调节G蛋白偶联受体98抑制结直肠癌细胞的奥沙利铂耐药性

• 作者: 付强 张永磊 张金岱 成静 罗素霞 谢建国 陈小兵
• 来源期刊: 中华胃肠外科杂志
• 关键词: 结直肠肿瘤 G蛋白偶联受体98 MiR-145 HCT116细胞株 奥沙利铂
• 年，卷（期）: 2017,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 566-573
• 页数: 8页
• 字数: 5580字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0274.2017.05.018

摘要

目的 预测鉴定miR-145靶基因,探讨miR-145抑制结直肠癌细胞株HCT116奥沙利铂(L-OHP)耐药性的机制.方法 在人结直肠癌细胞株HCT116的基础上,建立人结直肠癌L-OHP耐药细胞株HCT116/L-OHP.脂质体转染法将miR-145的模拟体miRNA-mimics及阴性对照NC-miRNA转染入HCT116/L-OHP,得到过表达miR-145的细胞株HCT116/L-OHPmimics及其阴性对照HCT116/L-OHPNC.预测miR-145的靶基因并用荧光素酶方法验证.确定靶基因为G蛋白偶联受体98(GPR98)后,构建质粒并转染细胞,得到过表达GPR98的HCT116/L-OHPGPR98细胞及其对照HCT116/L-OHPcontrol;同时通过更改GPR98 cDNA中与miR-145结合的序列,得到同时过表达GPR98和miR-145的HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞.本研究采用CCK-8法检测细胞的增殖能力[吸光值(A)]值和对L-OHP的敏感性(被测拮抗剂的半抑制浓度IC50越低,代表对药物的敏感性越强).实时定量PCR检测miR-145和GPR98的mRNA表达水平;western blot法检测GPR98和耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药蛋白1(MRP1)以及抑癌基因PTEN的蛋白表达水平.结果 成功建立耐药细胞株HCT116/L-OHP[IC50:(42.34±1.05)μg/ml,高于HCT116细胞的(9.81±0.95)μg/ml,t=39.784,P=0.000;miR-145:0.27±0.04,低于HCT116细胞的1.00±0.09,t=13.021,P=0.000].在HCT116/L-OHP基础上,成功构建HCT116/L-OHPmimics细胞[miR-145:10.01±1.05,高于HCT116/L-OHPNC(1.06±0.14)和HCT116/L-OHP(1.00±0.16),F=161.797,P=0.000].GPR98经鉴定是miR-145的靶基因.HCT116/L-OHPGPR98细胞中GPR98的mRNA和蛋白相对表达分别为8.48±0.46和1.71±0.09,与HCT116/L-OHPcontrol(mRNA:3.65±0.40;蛋白:1.21±0.10)和HCT116/L-OHP(mRNA:3.49±0.35;蛋白:1.22±0.08)比较,差异有统计学意义(均P<0.05).HCT116/L-OHPGPR98细胞A450值为1.31±0.10,高于HCT116/L-OHP(0.82±0.08,t=6.251,P=0.000);HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞A450值为0.89±0.08,高于HCT116/L-OHPmimics(0.20±0.05,t=11.158,P=0.000).HCT116/L-OHPGPR98细胞中耐药蛋白P-gp和MRP1的相对表达水平分别为1.53±0.18和1.49±0.20,高于HCT116/L-OHP细胞(分别为1.00±0.06和1.21±0.13),而抑癌蛋白PTEN的相对表达水平为0.12±0.03,低于HCT116/L-OHP细胞(1.25±0.14),差异均有统计学意义(均P<0.05).HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞P-gp和MRP1的蛋白相对表达水平分别为1.02±0.24和1.38±0.25,高于HCT116/L-OHPmimics(分别为0.20±0.07和0.55±0.10),而PTEN的蛋白相对表达水平为1.41±0.16,低于HCT116/L-OHPmimics(1.98±0.13),差异均有统计学意义(均P<0.05).HCT116/L-OHPGPR98 IC50为(73.54±1.21)μg/ml,高于HCT116/L-OHP的(41.25±1.56)μg/ml(t=25.041,P=0.000);HCT116/L-OHPmimics+GPR98 IC50为(48.80±1.75)μg/ml,高于HCT116/L-OHPmimics的(19.20±0.81)μg/ml(t=22.994,P=0.000).结论 miR-145通过抑制靶基因GPR98的表达水平,从而抑制人结直肠癌细胞株HCT116细胞的L-OHP耐药性.