人羊膜上皮细胞培养工艺的优化及生物学特性

• 作者: 刘洋 刘超 徐志国 徐春艳 杨旭巍 王绍红 程红玲 贡波
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 干细胞 培养 人羊膜上皮细胞 正交法 生物学特性 冻存工艺
• 年，卷（期）: 2017,（13）
• 所属期刊栏目: 干细胞培养与分化
• 页码范围: 2100-2107
• 页数: 8页
• 分类号: R394.2
• 字数: 9551字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.022

摘要

背景:目前人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存的研究较为分散,难以形成全面有效的方案以满足未来对移植用干细胞的临床需求.目的:建立人羊膜上皮细胞优化的分离、培养与冻存工艺,并对其生物学特性进行研究.方法:运用正交法研究各因素对人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存指标的影响,极差法分析数据得到优化的分离、培养与冻存工艺条件.对人羊膜上皮细胞进行原代与传代培养,通过镜下形态学观察,绘制细胞生长曲线,进行流式细胞术检测、免疫荧光染色及向肝样细胞分化等实验,观察人羊膜上皮细胞的生物学特性.结果与结论:①获得优化的人羊膜上皮细胞分离条件为:胰酶浓度0.25%,分4次消化,每次消化时间20 min;优化培养条件为:细胞接种浓度为4×108 L-1,表皮生长因子质量浓度为10μg/L,血清体积分数为5%;优化冻存条件为:细胞冻存浓度为1×1010 L-1,二甲基亚砜浓度为10%,血清体积分数为80%;②原代细胞在接种二三天内贴壁生长,贴壁后细胞呈不规则多角形,以铺路石样生长,传代后细胞贴壁与生长速度加快,冻存复苏的传代第2代细胞生长与扩增能力无明显下降;③免疫荧光染色显示,原代人羊膜上皮细胞强表达CK19、SSEA-4,不表达Vimentin、CD45和HLA-DR;原代与传代第4代免疫表型检测显示,人羊膜上皮细胞在培养传代过程中有上皮间充质转化现象发生;④向肝样细胞分化实验中,免疫荧光染色显示,诱导后的人羊膜上皮细胞肝细胞标志物白蛋白、CK18表达量明显上升,糖原染色显示诱导3周后的人羊膜上皮细胞有糖原合成;⑤结果表明,人羊膜上皮细胞易于获得且体外增殖能力强,表达胚胎干细胞保持未分化状态的表面标志物.