突变质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的构建及表达

• 作者: 刘化蝶 周文涛 周晓涛 夏开德 彭震 李家大 赵云娟 迪丽娜尔·波拉提 陈丹娜
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: hPROKR2 连续多位点碱基突变 限制性内切酶NotⅠ 质粒构建
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 113-118,150
• 页数: 7页
• 分类号: Q524
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.02.0021

摘要

[目的]构建CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353) 真核表达质粒并观察其蛋白表达.[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC) 引入第一次 PCR 的后引物,扩增并突变 hPROKR2 的 1-1035 bp (343YFK/AAA345) ,再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变hPROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353) ,通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353) ,最后通过测序鉴定突变是否成功.扩增 hPROKR2 (343YFK/AAA345,351HWR/AAA353) ,连接入CMV-3flag.Western Blot检测相应蛋白的表达.[结果]成功构建CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达.[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效.质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345, 351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件.