利用CRISPR/Cas9技术构建PERV敲除的PK15细胞系

• 作者: 张健民 李黎 蒙红毅 高毅
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 猪内源性逆转录病毒(PERV) 基因敲除 CRISPR/Cas9 PK15细胞系
• 年，卷（期）: 2018,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 513-519,525
• 页数: 8页
• 分类号: Q291
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.06.0089

摘要

[目的]利用CRISPR/Cas9技术对猪内源性逆转录病毒(PERV)进行编码区的大片段敲除,获得PERV敲除的阳性PK15单克隆细胞系.[方法]通过对巴马小型猪基因组进行高通量测序,获得PERV高度保守序列,再根据CRISPR/Cas9的构建原理,设计2个gRNA,并将其同时整合入含有PB转座子的可表达Cas9蛋白的载体中,即PB-CAG-2×gRNA-Cas9载体.然后以电转方式将打靶载体转入PK15细胞中,并通过药物(G418)筛选方法筛出单细胞克隆.通过PCR鉴定,挑出阳性克隆,并将其传代扩大获得细胞系.[结果]酶切、测序验证了载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9的正确性,PCR结果显示7株单克隆细胞系均有约3600bp的PERV大片段敲除.[结论]构建了PERV敲除的基因打靶载体PB-CAG-2 × gRNA-Cas9,并利用该载体成功打靶获得了7株PERV大片段敲除的PK15细胞系.