苹果N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达

• 作者: 吴成成 李保华 梁文星 王彩霞 练森
• 来源期刊: 植物生理学报
• 关键词: 苹果 MpASMT1 克隆 生物信息学 原核表达
• 年，卷（期）: 2018,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 173-181
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13592/j.cnki.ppj.2017.0299

摘要

以'富士'和'嘎啦'苹果(Malus pumila)叶片总RNA为模板,利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶(ASMT)基因,通过DNAMAN、MEGA 5.1、ProtParam等生物信息学软件对基因cDNA序列、系统进化关系、理化性质等进行分析,将克隆的苹果ASMT基因与表达载体pET32a连接,构建原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosetta(DE3)中,优化原核表达条件,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的可溶性,用蛋白免疫印迹法(western blot)和酶活性测定验证目的蛋白的表达.结果表明,获得了苹果ASMT的全长cDNA序列,命名为MpASMT1(GenBank登记号MF135479).该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码358个氨基酸.MpASMT1编码蛋白的理论分子量约为39.7 kDa,等电点为5.42,是非分泌型、疏水的稳定蛋白;其263位组氨酸(His)为催化位点,225位谷氨酸为底物S-腺苷甲硫氨酸结合位点.多序列比对及系统发生树分析表明,MpASMT1编码的氨基酸序列与珠美海棠(M.zumi)MzASMT1(KJ123721)同源性最高,相似性达99.2%,其次为葡萄(Vitis vinifera)ASMT(LOC100248671),氨基酸序列相似性为66.4%.原核表达结果显示,经0.25~2.0 mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组质粒可特异性表达分子量约58 kDa的融合蛋白,且低温条件(15和25°C)能够提高该蛋白的可溶性表达;west-ern blot分析表明融合表达蛋白能与His单克隆抗体特异性结合,纯化蛋白的酶活性为7.8 pmol·mg-1(蛋白),进一步证实MpASMT1编码蛋白成功表达.