达氏鲟内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的克隆及表达稳定性

• 作者: 吴源冰 周波 唐妮 李志琼 汪斌 王书瑶 陈德芳 陈虎 齐锦雯 龙治海
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 达氏鲟 内参基因 β-actin GAPDH EF1-α
• 年，卷（期）: 2018,（11）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1846-1855
• 页数: 10页
• 分类号: S9
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.11.003

摘要

达氏鲟(Acipenser dabryanus)是我国一类保护动物,具有重要的生态保护和种质资源价值.qRT-PCR等分子生物学技术在达氏鲟的保护和种质资源开发过程发挥着重要作用.qRT-PCR技术中内参基因的选择关系到检测结果的准确性.为筛选达氏鲟合适的内参基因,本实验用同源克隆结合本地Blast法克隆得到达氏鲟3个潜在的内参基因:β肌动蛋白(β-actin) (GenBank No.MH790260)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) (GenBank No.MH790259)、和延伸因子1α(elongation factor 1α,EF1-α)(GenBank No.MH790258);采用软件Mega 5.05、DNAStar 7.1、CPHmodels 3.2 和ClustalW 2.1分析3个基因的生物信息;使用qRT-PCR分析3个基因在达氏鲟脑、肝脏、肾脏、胰脏、脾脏、食道、胃、幽门盲囊、十二指肠、瓣肠、直肠、肌肉、鳃和皮肤组织中的Cq值,并使用软件geNorm,NormFinder和BestKeeper分析3个基因在14个组织中的表达稳定性.结果表明,达氏鲟潜在qRT-PCR内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的全长CDS分别为1 125、999和1 383 bp,分别编码375、333和461个氨基酸.生物信息学分析显示,3个基因推导的氨基酸序列和蛋白三维结构与其他物种高度一致.设计的β-actin、GAPDH和EF1-α qRT-PCR引物的扩增效率分别为92.2％、93.0％和92.7％;扩增产物的解链温度(m)值分别为84、83.5和85℃.综合geNorm,NormFinder和BestKeeper对3个内参基因14个组织表达稳定性的评价结果表明,3种内参基因的稳定性分别为EF 1-α＞ β-actin＞ GAPDH,且EF1-α和β-actin可作为达氏鲟qRT-PCR研究的内参基因.本实验获得达氏鲟3个潜在的内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的全长CDS,并证实EF1-α和β-actin适用于达氏鲟qRT-PCR研究,这将为qRT-PCR技术在达氏鲟研究中的应用提供基础资料.