基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

• 作者: 刘振兴 曹俊明 李盈 柯浩 梁志凌 郝乐 马江耀 马艳平
• 来源期刊: 南方水产科学
• 学科: 农学
• 关键词: 鲤疱疹病毒3型 ORF65 B细胞表位融合表达 rProteinG亲和层析 ELISA 抗体特异性检测
• 年，卷（期）: 2018,（3）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 113-119
• 页数: 7页
• 分类号: S917.1
• 字数: 5162字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.03.014

摘要

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1785 bp,编码594个氨基酸.该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短ORF65(truncated ORF65)插入pET32a(+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a(+)载体,构建了pET32a-modORF65.重组质粒分别转入BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和West-ern-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD.此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体.在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体.