大鼠椎间盘巢源性干细胞对退化髓核细胞作用的研究

• 作者: 吴小涛 张聪 时睿 洪鑫 王小虎 王运涛 王锋 谢志阳 陈露 鲍军平
• 来源期刊: 中国脊柱脊髓杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 椎间盘退变 髓核细胞 衰老 修复
• 年，卷（期）: 2018,（11）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1034-1042
• 页数: 9页
• 分类号: R339.4
• 字数: 7250字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-406X.2018.11.11

摘要

目的:研究大鼠椎间盘巢源性干细胞(stem cells derived from ISN,ISN-SCs)对衰老髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)的作用.方法:取10只SD大鼠(雄性,10周龄),处死后分离获取脊柱功能单位,显露髓核及椎间盘干细胞巢(stem cell niches of the intervertebral disc,ISN)区域,解剖显微镜下仔细分离获取髓核和ISN组织,采用Ⅱ型胶原酶消化、细胞滤网过滤后,将原代ISN-SCs和NPCs分别重悬于培养液,接种于普通培养箱培养,细胞达约90％融合后进行传代,第三代(P3)NPCs及第四代(P4)ISN-SCs用于进一步实验.采用三系诱导分化(成骨、成软骨、成脂肪)培养液对P4 ISN-SCs分别进行定向诱导分化培养,采用茜素红、钙钴染色检测其成骨分化能力,阿利新蓝染色检测其成软骨分化能力,油红O染色检测其成脂肪分化能力;采用连续传代法,将P3 NPCs连续传代,制备NPCs衰老模型,衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-Gal)染色法检测衰老模型的有效性.研究将细胞培养体系进一步分为正常对照组、衰老组、共培养组,正常对照组采用P3NPCs接种,衰老组采用衰老NPCs接种,共培养组采用P4 ISN-SCs与衰老NPCs以1∶1混匀后接种,各组样本细胞总数及培养环境相同.培养1周后,采用甲苯胺蓝染色检测各组蛋白聚糖表达水平,采用免疫组化检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达水平,采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测各组ACAN和COL2a1的mRNA表达水平.结果:在特定诱导环境下,ISN-SCs可以定向成骨、成软骨、成脂肪分化.SA-β-Gal染色显示连续传代后NPCs衰老率随着传代次数而逐渐增加,P3 NPCs未出现明显的衰老[衰老率(3.0±0.5)％],P5 NPCs衰老率为(18.3±0.7)％,P10 NPCs达到严重衰老标准[衰老率为(86.0±4.6)％].胞外基质蛋白检测结果显示:与正常对照组相比,衰老组的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色明显减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度定量也显著减弱(P＜0.05);而接触共培养后,与衰老组相比,共培养组中的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色明显增强,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度定量显著增强(P＜0.05)并恢复至正常水平.qPCR结果显示:与正常对照组相比,衰老组的ACAN和COL2a1的mRNA表达水平均显著性降低(分别为1.00±0.05 vs 0.43±0.03,P＜0.05;1.00±0.03 vs 0.40±0.02,P＜0.05);接触共培养后,与衰老组相比,共培养组中ACAN和COL2a1的mRNA表达水平均显著性增加(分别为0.43±0.03 vs 0.99±0.05,P＜0.05;0.40±0.02 vs1.07±0.04,P＜0.05),且与正常组相比无显著性差异.结论:ISN-SCs具有较好的三系分化能力,通过接触共培养能够提高胞外基质蛋白和基因的表达水平,对衰老NPCs产生良好的修复作用,为后续ISN-SCs修复椎间盘的体内研究打下理论基础.