悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

• 作者: 付春杰 孟令伟 宋海岩 张丹 张天舒 李金祥 杨柳 石莹 蒋晓梅 赵海源 陈宏
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: MDCK细胞 重组禽流感病毒 悬浮培养 免疫效果
• 年，卷（期）: 2018,（17）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 3405-3414
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.015

摘要

[目的]为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持.[方法]选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异.分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果.海兰褐商品蛋鸡:6050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,5 0只,同等条件下隔离饲养.分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长.长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组1 00只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养.分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长.[结果]获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产.此悬浮MDCK细胞培养48h细胞密度可由1.5×106cells/mL左右增殖到1.0×107 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中.以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1∶512,TCID50 107.67/mL,EID50 107.83/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1∶256,TCID50达107.33/mL,EID50107.17/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1∶1024,TCID50 108.5/mL,EID50 108.38/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当.细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1∶446、1∶111、1∶416,二免后30d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1∶588、1∶362、1∶776,6个月时分别为1∶239、1∶128、1∶223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1∶30、1∶17、1∶64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1∶194、1∶91、1∶137,42d时分别为1∶416、1∶128、1∶239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当.[结论]经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体.为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持.