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摘要:
[背景]PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用.前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1 (poly (rC)-binding protein 1,PCBP1).[目的]探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据.[方法]将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒pGADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5-7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用.参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用.利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-ZsGreen1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数.合成PCBP1蛋白的siRNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数.[结果]通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒pGADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Ga1,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用.免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用.在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过siRNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用.[结论]通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用.
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蛋白质-蛋白质相互作用
哺乳动物双杂交
免疫共沉淀
内容分析
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文献信息
篇名 流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用
来源期刊 中国农业科学 学科
关键词 酵母双杂交 流感病毒 PA蛋白 PCBP1蛋白 蛋白互作
年,卷(期) 2018,(17) 所属期刊栏目 畜牧·兽医·资源昆虫
研究方向 页码范围 3389-3396
页数 8页 分类号
字数 语种 中文
DOI 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.013
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研究主题发展历程
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酵母双杂交
流感病毒
PA蛋白
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蛋白互作
研究起点
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引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
中国农业科学
半月刊
0578-1752
11-1328/S
大16开
北京中关村南大街12号
2-138
1960
chi
出版文献量(篇)
9193
总下载数(次)
12
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254208
相关基金
中国博士后科学基金
英文译名:China Postdoctoral Science Foundation
官方网址:http://www.chinapostdoctor.org.cn/index.asp
项目类型:
学科类型:
国家自然科学基金
英文译名:the National Natural Science Foundation of China
官方网址:http://www.nsfc.gov.cn/
项目类型:青年科学基金项目(面上项目)
学科类型:数理科学
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