2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

• 作者: 侯红芬 吴倩倩 李超龙 潘秀珍 王长军 高基民
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 学科: 医学
• 关键词: 2型猪链球菌 低分子量酪氨酸磷酸酶 原核表达
• 年，卷（期）: 2018,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 588-594
• 页数: 7页
• 分类号: R378.1
• 字数: 4608字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.103

摘要

目的 表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础.方法分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化E coil BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物.镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体.以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性.结果成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23 kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP.制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1:102400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应.对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1 nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性.结论成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys33和Arg39是LMW-PTP的活性位点.为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	高基民	温州医科大学检验医学院生命科学学院	32	23	2.0	4.0
3	吴倩倩	温州医科大学检验医学院生命科学学院	4	3	1.0	1.0
5	潘秀珍	温州医科大学检验医学院生命科学学院	2	1	1.0	1.0
7	侯红芬		2	1	1.0	1.0
8	王长军		3	7	1.0	2.0
13	李超龙		1	1	1.0	1.0