提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法

• 作者: 刘伟 刘平 平键 张定棋 徐莹 慕永平 王清兰 陈佳美
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 肝星状细胞 细胞分离技术 原代细胞 细胞外基质 荧光鉴定 肝纤维化 细胞得率 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2018,（21）
• 所属期刊栏目: 干细胞培养与分化
• 页码范围: 3376-3380
• 页数: 5页
• 分类号: R394.2
• 字数: 5962字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.0903

摘要

背景:由于小鼠肝脏小、血管较细,其原代肝星状细胞分离的难度相对较大,且得率有限,难以满足体外实验需求.目的:建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法,提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度,为研究肝纤维化的机制奠定实验基础.方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏,再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/LⅣ型胶原酶灌注,使用Nycodenz进行梯度密度离心,获取中间层原代肝星状细胞,锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力,流式细胞法检测细胞纯度,免疫荧光法检测Desmin表达,并于倒置显微镜下观察细胞培养3,5,7 d后的形态变化,PCR法检测培养3,5,7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况.结果与结论:①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×106个,锥虫蓝检测细胞活力均大于95%,流式细胞法检测细胞纯度为94%,免疫荧光检测细胞高表达Desmin;②随着体外培养时间的延长,可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展;③随培养天数增长,α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高;④结果提示,实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法,可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案,也为肝纤维化的机制研究提供技术保障.