过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

• 作者: 张伟 杨向东 杨静 牛陆 贺红利 赵倩倩 邢国杰
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 大豆 大豆花叶病毒 PAC1 农杆菌介导转化 抗性
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 217-225
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.002

摘要

[目的]大豆花叶病毒(oybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质.核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累.PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因.本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据.[方法]采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1.目的基因启动子为组成型强启动子CaMV35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR.采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82.在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂(500 mg·L-1Basta)喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数.采用人工摩擦接种法,对T2和T3代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性.并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平.[结果]共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦(5 mg·L-1)大豆再生植株76株.PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48％.对T1-T3代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L-1 Basta处理7d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照(非转基因大豆)植株叶片则黄化枯死.Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中.摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照(病情指数36.81-46.24)显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传.qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降.农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异.[结论]PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平.