截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析

• 作者: 刘海峰 初彦辉 左魁阳 李桂芹 王小花 韩瑞杰
• 来源期刊: 广东医学
• 关键词: TGFβⅡ型受体 包涵体 纯化
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1124-1128
• 页数: 5页
• 字数: 4586字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1001-9448.2018.08.003

摘要

目的 构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域( thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性.方法 以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段( pGEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有 NdeI和BamHI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体pET28a,命名为pET28a-thTβRⅡ.将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的pET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni2+亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响.结果 pET28a -thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌 Rossta/pET28a -thTβRⅡ在37℃经0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni2+亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD, MTT显示150 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达.结论 成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2 细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘海峰	牡丹江医学院医药研究中心	16	41	4.0	5.0
2	初彦辉	牡丹江医学院医药研究中心	54	189	7.0	10.0
3	李桂芹	牡丹江医学院附属红旗医院肾内科	27	109	6.0	10.0
4	左魁阳	牡丹江医学院医药研究中心	4	15	2.0	3.0
5	王小花	牡丹江医学院基础医学院病原与免疫实验室	8	7	2.0	2.0
6	韩瑞杰	牡丹江医学院附属红旗医院肾内科	4	1	1.0	1.0