靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针检测人肝癌HepG2细胞线粒体ROS水平动态变化

• 作者: 刘晓宁 刘翠娥 薄惠
• 来源期刊: 山东医药
• 学科: 医学
• 关键词: 肝癌 HepG2细胞 活性氧 线粒体 靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 14-17
• 页数: 4页
• 分类号: R735.7
• 字数: 3048字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-266X.2018.08.004

摘要

目的 通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础.方法 采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定.将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况.将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与MitoTracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位.取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢(H2O2)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片.结果 成功构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体.制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×108 IU/mL.mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞.外源性氧化剂H2O2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值(405 nm/488 nm)从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25.结论 靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘晓宁	黄河科技学院医学院	13	21	3.0	4.0
2	薄惠	黄河科技学院医学院	28	30	2.0	3.0
3	刘翠娥	黄河科技学院医学院	3	1	1.0	1.0